این مقاله نحوه انتخاب ستون کروماتوگرافی مایع را به شما آموزش می دهد

کروماتوگرافی مایع روش اصلی برای آزمایش محتوای هر جزء و ناخالصی‌ها در مواد اولیه، واسطه‌ها، آماده‌سازی‌ها و مواد بسته‌بندی است، اما بسیاری از مواد روش‌های استانداردی برای تکیه ندارند، بنابراین توسعه روش‌های جدید اجتناب‌ناپذیر است. در توسعه روش های فاز مایع، ستون کروماتوگرافی هسته کروماتوگرافی مایع است، بنابراین نحوه انتخاب یک ستون کروماتوگرافی مناسب بسیار مهم است. در این مقاله، نویسنده نحوه انتخاب ستون کروماتوگرافی مایع را از سه جنبه توضیح می دهد: ایده های کلی، ملاحظات و دامنه کاربرد.

الف. ایده های کلی برای انتخاب ستون های کروماتوگرافی مایع

1. ارزیابی خواص فیزیکی و شیمیایی آنالیت: مانند ساختار شیمیایی، حلالیت، پایداری (مانند اینکه آیا اکسید شدن/کاهش/هیدرولیز شدن آسان است)، اسیدیته و قلیاییت و غیره، به ویژه ساختار شیمیایی کلید اصلی است. عامل در تعیین خواص، مانند گروه مزدوج دارای جذب قوی ماوراء بنفش و فلورسانس قوی است.

2. تعیین هدف تجزیه و تحلیل: آیا جداسازی بالا، بازده ستون بالا، زمان تجزیه و تحلیل کوتاه، حساسیت بالا، مقاومت در برابر فشار بالا، طول عمر ستون، هزینه کم و غیره مورد نیاز است یا خیر.

1. یک ستون کروماتوگرافی مناسب انتخاب کنید: ترکیب، خواص فیزیکی و شیمیایی پرکننده کروماتوگرافی مانند اندازه ذرات، اندازه منافذ، تحمل دما، تحمل pH، جذب آنالیت و غیره را درک کنید.

1. ملاحظات برای انتخاب ستون های کروماتوگرافی مایع

این فصل عواملی را که باید هنگام انتخاب ستون کروماتوگرافی در نظر گرفته شود از منظر خواص فیزیکی و شیمیایی خود ستون کروماتوگرافی مورد بحث قرار خواهد داد. 2.1 ماتریس پرکننده

2.1.1 ماتریس ژل سیلیکا ماتریس پرکننده اکثر ستون های کروماتوگرافی مایع سیلیکا ژل است. این نوع پرکننده دارای خلوص بالا، هزینه کم، استحکام مکانیکی بالا است و به راحتی می توان گروه ها را تغییر داد (مانند پیوند فنیل، پیوند آمینو، پیوند سیانو و غیره)، اما مقدار pH و محدوده دمایی که تحمل می کند محدود است: محدوده pH اکثر پرکننده‌های ماتریکس سیلیکاژل 2 تا 8 است، اما محدوده pH فازهای پیوند شده با سیلیکاژل اصلاح‌شده خاص می‌تواند از 1.5 تا 10 باشد، و همچنین فازهای پیوندی سیلیکاژل اصلاح‌شده مخصوصاً وجود دارند که در pH پایین پایدار هستند. مانند Agilent ZORBAX RRHD stablebond-C18 که در pH 1 تا 8 پایدار است. حد بالای دمای ماتریس ژل سیلیکا معمولاً 60 درجه سانتیگراد است و برخی از ستونهای کروماتوگرافی می توانند دمای 40 درجه سانتیگراد را در pH بالا تحمل کنند.

2.1.2 ماتریس پلیمری پرکننده های پلیمری عمدتاً پلی استایرن-دیوینیل بنزن یا پلی متاکریلات هستند. مزایای آنها این است که می توانند محدوده pH گسترده ای را تحمل کنند - آنها را می توان در محدوده 1 تا 14 استفاده کرد و در برابر دماهای بالا مقاوم تر هستند (می تواند به بالای 80 درجه سانتیگراد برسد). در مقایسه با پرکننده‌های C18 مبتنی بر سیلیس، این نوع پرکننده آبگریزی قوی‌تری دارد و پلیمر ماکرو متخلخل در جداسازی نمونه‌هایی مانند پروتئین‌ها بسیار مؤثر است. معایب آن این است که راندمان ستون کمتر و استحکام مکانیکی ضعیف تر از پرکننده های مبتنی بر سیلیس است. 2.2 شکل ذرات

بیشتر پرکننده های HPLC مدرن، ذرات کروی هستند، اما گاهی اوقات آنها ذرات نامنظم هستند. ذرات کروی می توانند فشار ستون کمتر، راندمان ستون بالاتر، پایداری و عمر طولانی تر را فراهم کنند. هنگام استفاده از فازهای متحرک با ویسکوزیته بالا (مانند اسید فسفریک) یا زمانی که محلول نمونه چسبناک است، ذرات نامنظم دارای سطح ویژه بزرگ تری هستند که برای عملکرد کامل دو فاز مفیدتر است و قیمت نسبتاً پایین است. 2.3 اندازه ذرات

هرچه اندازه ذرات کوچکتر باشد، بازده ستون و جداسازی بیشتر است، اما مقاومت فشار بالا بدتر است. رایج ترین ستون مورد استفاده ستون اندازه ذرات 5 میکرومتر است. اگر نیاز جداسازی زیاد باشد، می‌توان یک پرکننده 1.5-3 میکرومتری انتخاب کرد که برای حل مشکل جداسازی برخی از ماتریس‌های پیچیده و نمونه‌های چند جزئی مناسب است. UPLC می تواند از پرکننده های 1.5 میکرومتر استفاده کند. پرکننده های اندازه ذرات 10 میکرومتر یا بزرگتر اغلب برای ستون های نیمه آماده سازی یا آماده سازی استفاده می شوند. 2.4 محتوای کربن

محتوای کربن به نسبت فاز پیوندی روی سطح ژل سیلیکا اشاره دارد که به سطح ویژه و پوشش فاز پیوندی مربوط می شود. محتوای کربن بالا ظرفیت ستون بالا و وضوح بالا را فراهم می کند و اغلب برای نمونه های پیچیده که نیاز به جداسازی بالایی دارند استفاده می شود، اما به دلیل زمان تعامل طولانی بین دو فاز، زمان تجزیه و تحلیل طولانی است. ستون‌های کروماتوگرافی با محتوای کربن کم زمان آنالیز کوتاه‌تری دارند و می‌توانند گزینش پذیری‌های متفاوتی را نشان دهند و اغلب برای نمونه‌های ساده که نیاز به تجزیه و تحلیل سریع دارند و نمونه‌هایی که به شرایط فاز آبی بالا نیاز دارند استفاده می‌شوند. به طور کلی، محتوای کربن C18 از 7٪ تا 19٪ متغیر است. 2.5 اندازه منافذ و سطح خاص

محیط های جذب HPLC ذرات متخلخل هستند و بیشتر فعل و انفعالات در منافذ صورت می گیرد. بنابراین مولکول ها باید وارد منافذ شوند تا جذب و جدا شوند.

اندازه منافذ و سطح ویژه دو مفهوم مکمل یکدیگر هستند. اندازه منافذ کوچک به معنای سطح ویژه بزرگ است و بالعکس. یک سطح خاص بزرگ می تواند برهمکنش بین مولکول های نمونه و فازهای پیوندی را افزایش دهد، ماندگاری را افزایش دهد، بارگذاری نمونه و ظرفیت ستون را افزایش دهد و اجزای پیچیده را جدا کند. پرکننده های کاملا متخلخل متعلق به این نوع پرکننده ها هستند. برای کسانی که نیاز به جداسازی بالایی دارند، توصیه می شود پرکننده هایی با سطح ویژه بزرگ انتخاب کنند. سطح ویژه کوچک می تواند فشار برگشتی را کاهش دهد، کارایی ستون را بهبود بخشد و زمان تعادل را کاهش دهد که برای تجزیه و تحلیل گرادیان مناسب است. پرکننده های هسته ای متعلق به این نوع پرکننده ها هستند. برای اطمینان از جداسازی، توصیه می‌شود پرکننده‌هایی با سطح ویژه کوچک برای آنهایی که نیاز به راندمان آنالیز بالایی دارند، انتخاب کنید. 2.6 حجم منافذ و استحکام مکانیکی

حجم منافذ که به عنوان "حجم منافذ" نیز شناخته می شود، به اندازه حجم خالی در واحد ذره اشاره دارد. به خوبی می تواند مقاومت مکانیکی پرکننده را منعکس کند. استحکام مکانیکی پرکننده‌هایی با حجم منافذ زیاد کمی ضعیف‌تر از پرکننده‌هایی با حجم منافذ کوچک است. پرکننده‌هایی با حجم منافذ کمتر یا مساوی 1.5 میلی‌لیتر بر گرم بیشتر برای جداسازی HPLC استفاده می‌شوند، در حالی که پرکننده‌هایی با حجم منافذ بیشتر از 1.5 میلی‌لیتر بر گرم عمدتاً برای کروماتوگرافی حذف مولکولی و کروماتوگرافی کم فشار استفاده می‌شوند. 2.7 نرخ سقف

درپوش می‌تواند پیک‌های باطله ناشی از برهمکنش بین ترکیبات و گروه‌های سیلانول در معرض را کاهش دهد (مانند پیوند یونی بین ترکیبات قلیایی و گروه‌های سیلانول، نیروهای واندروالس و پیوندهای هیدروژنی بین ترکیبات اسیدی و گروه‌های سیلانول)، در نتیجه کارایی ستون و شکل قله را بهبود می‌بخشد. . فازهای باند بدون درپوش، گزینش پذیری های متفاوتی نسبت به فازهای پیوندی سرپوش دار، به ویژه برای نمونه های قطبی ایجاد می کنند.

1. دامنه کاربرد ستون های کروماتوگرافی مایع مختلف

این فصل دامنه کاربرد انواع مختلف ستون‌های کروماتوگرافی مایع را در برخی موارد شرح می‌دهد.

3.1 ستون کروماتوگرافی C18 فاز معکوس

ستون C18 متداول ترین ستون فاز معکوس است که می تواند آزمایشات محتوایی و ناخالصی اکثر مواد آلی را برآورده کند و برای مواد با قطب متوسط، ضعیف قطبی و غیر قطبی قابل استفاده است. نوع و مشخصات ستون کروماتوگرافی C18 باید با توجه به الزامات جداسازی خاص انتخاب شود. به عنوان مثال، برای موادی که نیاز به جداسازی بالایی دارند، اغلب از مشخصات 5 میکرومتر * 4.6 میلی متر * 250 میلی متر استفاده می شود. برای موادی با ماتریس های جداسازی پیچیده و قطبیت مشابه، می توان از مشخصات 4 میکرومتر * 4.6 میلی متر * 250 میلی متر یا اندازه ذرات کوچکتر استفاده کرد. به عنوان مثال، نویسنده از یک ستون 3 میکرومتر * 4.6 میلی متر * 250 میلی متر برای تشخیص دو ناخالصی ژنوتوکسیک در سلکوکسیب API استفاده کرد. تفکیک این دو ماده می تواند به 2.9 برسد که بسیار عالی است. علاوه بر این، با فرض اطمینان از جداسازی، در صورت نیاز به تجزیه و تحلیل سریع، ستون کوتاه 10 میلی متر یا 15 میلی متر اغلب انتخاب می شود. به عنوان مثال، زمانی که نویسنده از LC-MS/MS برای تشخیص ناخالصی ژنوتوکسیک در پیپراکین فسفات API استفاده کرد، یک ستون 3 میکرومتر * 2.1 میلی متر * 100 میلی متر استفاده شد. تفکیک بین ناخالصی و جزء اصلی 2.0 بود و تشخیص نمونه در 5 دقیقه کامل می شود. 3.2 ستون فنیل فاز معکوس

ستون فنیل نیز نوعی ستون فاز معکوس است. این نوع ستون دارای گزینش پذیری قوی برای ترکیبات معطر است. اگر پاسخ ترکیبات معطر اندازه گیری شده توسط ستون C18 معمولی ضعیف باشد، می توانید جایگزین ستون فنیل را در نظر بگیرید. به عنوان مثال، زمانی که من API سلکوکسیب را می ساختم، پاسخ جزء اصلی اندازه گیری شده توسط ستون فنیل همان سازنده و همان مشخصات (همه 5 میکرومتر * 4.6 میلی متر * 250 میلی متر) حدود 7 برابر ستون C18 بود. 3.3 ستون فاز عادی

به عنوان یک مکمل موثر برای ستون فاز معکوس، ستون فاز نرمال برای ترکیبات بسیار قطبی مناسب است. اگر در هنگام شستشو با بیش از 90 درصد فاز آبی در ستون فاز معکوس، پیک همچنان بسیار سریع است، و حتی نزدیک به پیک حلال و همپوشانی با آن دارد، می‌توانید ستون فاز معمولی را جایگزین کنید. این نوع ستون ها شامل ستون هیلیک، ستون آمینو، ستون سیانو و ... می باشد.

3.3.1 ستون Hilic ستون Hilic معمولاً گروه های آبدوست را در زنجیره آلکیل پیوندی تعبیه می کند تا پاسخ به مواد قطبی را افزایش دهد. این نوع ستون برای آنالیز مواد قندی مناسب است. نویسنده هنگام انجام محتویات و مواد مرتبط زایلوز و مشتقات آن از این نوع ستون استفاده کرده است. ایزومرهای یک مشتق زایلوز نیز می توانند به خوبی از هم جدا شوند.

3.3.2 ستون آمینو و ستون سیانو ستون آمینو و ستون سیانو به ترتیب به معرفی اصلاحات آمینو و سیانو در انتهای زنجیره آلکیل پیوند خورده برای بهبود گزینش پذیری برای مواد خاص اشاره دارد: به عنوان مثال، ستون آمینه انتخاب خوبی است. برای جداسازی قندها، اسیدهای آمینه، بازها و آمیدها؛ ستون سیانو در هنگام جداسازی مواد مشابه ساختاری هیدروژنه و غیرهیدروژنه به دلیل وجود پیوندهای مزدوج، انتخاب بهتری دارد. ستون آمینو و ستون سیانو اغلب می توانند بین ستون فاز معمولی و ستون فاز معکوس جابجا شوند، اما تعویض مکرر توصیه نمی شود. 3.4 ستون کایرال

ستون کایرال همانطور که از نامش پیداست برای جداسازی و آنالیز ترکیبات کایرال به ویژه در زمینه داروسازی مناسب است. این نوع ستون را می توان زمانی در نظر گرفت که ستون های فاز معکوس معمولی و فاز عادی نتوانند به جداسازی ایزومرها دست یابند. به عنوان مثال، نویسنده از یک ستون کایرال 5 میکرومتر * 4.6 میلی متر * 250 میلی متر برای جدا کردن دو ایزومر 1،2-دی فنیل اتیلن دی آمین استفاده کرد: (1S, 2S)-1, 2-diphenylethylenediamine و (1R, 2R)-1, 2 -دی فنیل اتیلن دی آمین، و جدایی بین این دو به حدود 2.0 رسید. با این حال، ستون‌های کایرال گران‌تر از سایر انواع ستون‌ها هستند، معمولاً 1W+/piece. در صورت نیاز به چنین ستون هایی، واحد نیاز به بودجه کافی دارد. 3.5 ستون تبادل یونی

ستون های تبادل یونی برای جداسازی و تجزیه و تحلیل یون های باردار مانند یون ها، پروتئین ها، اسیدهای نوکلئیک و برخی مواد قندی مناسب هستند. با توجه به نوع پرکننده، آنها به ستون های تبادل کاتیونی، ستون های تبادل آنیونی و ستون های تبادل کاتیونی قوی تقسیم می شوند.

ستون‌های تبادل کاتیونی شامل ستون‌های مبتنی بر کلسیم و هیدروژن هستند که عمدتاً برای تجزیه و تحلیل مواد کاتیونی مانند اسیدهای آمینه مناسب هستند. برای مثال، نویسنده هنگام تجزیه و تحلیل گلوکونات کلسیم و استات کلسیم در محلول شستشو از ستون‌های مبتنی بر کلسیم استفاده کرد. هر دو ماده پاسخ قوی در λ = 210nm داشتند، و درجه جدایی به 3.0 رسید. نویسنده هنگام تجزیه و تحلیل مواد مرتبط با گلوکز از ستون های مبتنی بر هیدروژن استفاده کرد. چندین ماده مرتبط اصلی - مالتوز، مالتوتریوز و فروکتوز - در آشکارسازهای دیفرانسیل حساسیت بالایی داشتند، با حد تشخیص 0.5 ppm و درجه جدایی 2.0-2.5.

ستون های تبادل آنیون عمدتاً برای تجزیه و تحلیل مواد آنیونی مانند اسیدهای آلی و یون های هالوژن مناسب هستند. ستون های تبادل کاتیونی قوی ظرفیت تبادل یونی و گزینش پذیری بالاتری دارند و برای جداسازی و تجزیه و تحلیل نمونه های پیچیده مناسب هستند.

موارد فوق فقط مقدمه ای بر انواع و محدوده کاربرد چندین ستون کروماتوگرافی مایع رایج همراه با تجربه خود نویسنده است. انواع خاصی از ستون‌های کروماتوگرافی در کاربردهای واقعی وجود دارد، مانند ستون‌های کروماتوگرافی با منافذ بزرگ، ستون‌های کروماتوگرافی با منافذ کوچک، ستون‌های کروماتوگرافی میل ترکیبی، ستون‌های کروماتوگرافی چند حالته، ستون‌های کروماتوگرافی مایع با کارایی فوق‌العاده (UHPLC)، ستون‌های سیال فوق بحرانی (کروماتوگرافی ستون‌های سیال فوق بحرانی). SFC) و غیره نقش مهمی در زمینه های مختلف دارند. نوع خاص ستون کروماتوگرافی باید با توجه به ساختار و خواص نمونه، الزامات جداسازی و سایر اهداف انتخاب شود.