اصول و روشهای آنالیز کمی با کروماتوگرافی مایع

مکانیسم جداسازی کروماتوگرافی مایع بر اساس تفاوت در میل ترکیبی اجزای مخلوط برای دو فاز است.

با توجه به فازهای ثابت مختلف، کروماتوگرافی مایع به کروماتوگرافی مایع- جامد، کروماتوگرافی مایع- مایع و کروماتوگرافی فاز پیوندی تقسیم می شود.پرکاربردترین کروماتوگرافی مایع-جامد با سیلیکا ژل به عنوان پرکننده و کروماتوگرافی فاز پیوندی با میکروسیلیس به عنوان ماتریس است.

با توجه به شکل فاز ثابت، کروماتوگرافی مایع را می توان به کروماتوگرافی ستونی، کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی لایه نازک تقسیم کرد.با توجه به ظرفیت جذب، می توان آن را به کروماتوگرافی جذب، کروماتوگرافی پارتیشن، کروماتوگرافی تبادل یونی و کروماتوگرافی نفوذ ژل تقسیم کرد.

در سال های اخیر، یک سیستم جریان مایع با فشار بالا به سیستم کروماتوگرافی ستونی مایع اضافه شده است تا فاز متحرک به سرعت تحت فشار بالا جریان یابد تا اثر جداسازی بهبود یابد، بنابراین کروماتوگرافی مایع با راندمان بالا (همچنین به عنوان فشار بالا شناخته می شود). پدید آمده است.

بخش
01 اصل آنالیز کمی کروماتوگرافی مایع

برای تعیین کمیت بر اساس کیفی، مواد خالص به عنوان استاندارد مورد نیاز است.

کمی سازی کروماتوگرافی مایع یک روش نسبتا کمی است: یعنی مقدار آنالیت در مخلوط از مقدار مشخصی از نمونه استاندارد خالص تخمین زده می شود.

بخش
02 مبنایی برای کمی سازی توسط کروماتوگرافی مایع

مقدار مولفه اندازه گیری شده (W) متناسب با مقدار پاسخ (A) (ارتفاع پیک یا مساحت قله)، W=f×A است.

ضریب تصحیح کمی (f): ثابت تناسب فرمول محاسبه کمی است و معنای فیزیکی آن مقدار مولفه اندازه گیری شده با مقدار پاسخ واحد (مساحت پیک) نشان داده می شود.

ضریب تصحیح کمی را می توان از مقدار مشخص نمونه استاندارد و مقدار پاسخ آن به دست آورد.

مقدار پاسخ مولفه مجهول را اندازه گیری کنید و مقدار مولفه را می توان با ضریب تصحیح کمی به دست آورد.

بخش
03 اصطلاحات رایج در تحلیل کمی

نمونه (نمونه): محلولی حاوی آنالیت برای آنالیز کروماتوگرافی.به نمونه های استاندارد و ناشناخته تقسیم می شود.

استاندارد: یک محصول خالص با غلظت مشخص.نمونه ناشناخته (ناشناخته): مخلوطی که غلظت آن باید آزمایش شود.

وزن نمونه: وزن اولیه نمونه مورد آزمایش.

Dilution: ضریب رقت نمونه ناشناخته.

جزء: پیک کروماتوگرافی که باید به صورت کمی آنالیز شود، یعنی آنالیتی که محتوای آن ناشناخته است.

مقدار جزء (مقدار): محتوای (یا غلظت) ماده مورد آزمایش.

Integerity: فرآیند محاسباتی اندازه گیری مساحت پیک پیک کروماتوگرافی توسط کامپیوتر.

منحنی کالیبراسیون: منحنی خطی محتوای جزء در مقابل مقدار پاسخ که از مقدار مشخصی از ماده استاندارد ایجاد می‌شود و برای تعیین محتوای مجهول آنالیت استفاده می‌شود.

بخش
04 تجزیه و تحلیل کمی کروماتوگرافی مایع

1. یک روش کروماتوگرافی مناسب برای تجزیه و تحلیل کمی انتخاب کنید:

l پیک مولفه شناسایی شده را تأیید کنید و به وضوح (R) بیشتر از 1.5 برسید

l تعیین قوام (خوص) پیک های کروماتوگرافی اجزای آزمایش شده

l تعیین حد تشخیص و حد کمی روش.حساسیت و محدوده خطی

2. یک منحنی کالیبراسیون با نمونه های استاندارد با غلظت های مختلف ایجاد کنید

3. صحت و دقت روش های کمی را بررسی کنید

4. از نرم افزار مدیریت کروماتوگرافی مربوطه برای پیاده سازی جمع آوری نمونه، پردازش داده ها و گزارش نتایج استفاده کنید

بخش
05 شناسایی پیک های کمی (کیفی)

هر پیک کروماتوگرافیک را به صورت کیفی شناسایی کنید

ابتدا از نمونه استاندارد برای تعیین زمان ماند (Rt) پیک کروماتوگرافی که باید کمیت شود استفاده کنید.با مقایسه زمان ماند، جزء مربوط به هر پیک کروماتوگرافی در نمونه ناشناخته را پیدا کنید.روش کیفی کروماتوگرافی، مقایسه زمان ماند با نمونه استاندارد است.معیار ناکافی استتایید بیشتر (کیفی)

1. روش جمع استاندارد

2. از روش های دیگر به طور همزمان استفاده کنید: سایر روش های کروماتوگرافی (تغییر مکانیسم، مانند: استفاده از ستون های کروماتوگرافی مختلف)، آشکارسازهای دیگر (PDA: مقایسه طیف، جستجوی کتابخانه طیف؛ MS: تجزیه و تحلیل طیف جرمی، جستجوی کتابخانه طیف)

3. ابزار و روش های دیگر

بخش
06 تأیید ثبات اوج کمی

تایید قوام پیک کروماتوگرافی (خلوص)

اطمینان حاصل کنید که تنها یک جزء اندازه گیری شده در زیر هر پیک کروماتوگرافی وجود دارد

بررسی تداخل مواد شوینده همزمان (ناخالصی ها)

روش‌های تأیید قوام پیک کروماتوگرافی (خلوص)

مقایسه طیف‌نگارها با آشکارسازهای فوتودیود ماتریس (PDA).

شناسایی خلوص اوج

2996 نظریه زاویه خلوص

روش های کمی که معمولاً در بخش 07 استفاده می شود

روش منحنی استاندارد، به روش استاندارد خارجی و روش استاندارد داخلی تقسیم می شود:

1. روش استاندارد خارجی: بیشترین کاربرد را در کروماتوگرافی مایع دارد

مجموعه‌ای از نمونه‌های استاندارد با غلظت‌های شناخته شده با استفاده از نمونه‌های خالص ترکیبات برای آزمایش به عنوان نمونه‌های استاندارد تهیه شد.تا مقدار پاسخ آن (مساحت پیک) به ستون تزریق می شود.
در یک محدوده مشخص، رابطه خطی خوبی بین غلظت نمونه استاندارد و مقدار پاسخ، یعنی W=f×A وجود دارد و یک منحنی استاندارد ساخته می‌شود.

در شرایط آزمایشی دقیقاً مشابه، نمونه ناشناخته را تزریق کنید تا مقدار پاسخ جزء مورد اندازه گیری را بدست آورید.با توجه به ضریب شناخته شده f می توان غلظت جزء مورد اندازه گیری را بدست آورد.

مزایای روش استاندارد خارجی:عملیات و محاسبه ساده، یک روش کمی رایج است.بدون نیاز به شناسایی و شستشوی هر جزء.نمونه استاندارد مورد نیاز است.شرایط اندازه گیری نمونه استاندارد و نمونه ناشناخته باید سازگار باشد.حجم تزریق باید دقیق باشد.

معایب روش استاندارد خارجی:شرایط آزمایشی باید بالا باشد، مانند حساسیت آشکارساز، سرعت جریان، و ترکیب فاز متحرک قابل تغییر نیست.حجم هر تزریق باید تکرارپذیری خوبی داشته باشد.

2. روش استاندارد داخلی: دقیق، اما دردسرساز، بیشتر در روش های استاندارد استفاده می شود

مقدار مشخصی از استاندارد داخلی به استاندارد اضافه می شود تا یک استاندارد مخلوط ساخته شود و یک سری استانداردهای کاری با غلظت مشخص تهیه می شود.نسبت مولی استاندارد به استاندارد داخلی در استاندارد مختلط بدون تغییر باقی می ماند.به ستون کروماتوگرافی تزریق کنید و (منطقه پیک نمونه استاندارد/ منطقه پیک نمونه استاندارد داخلی) را به عنوان مقدار پاسخ در نظر بگیرید.با توجه به رابطه خطی بین مقدار پاسخ و غلظت استاندارد کاری، یعنی W=f×A، یک منحنی استاندارد ساخته می‌شود.

مقدار مشخص استاندارد داخلی به نمونه ناشناخته اضافه می شود و به ستون تزریق می شود تا مقدار پاسخ جزء مورد اندازه گیری به دست آید.با توجه به ضریب شناخته شده f می توان غلظت جزء مورد اندازه گیری را بدست آورد.

ویژگی های روش استاندارد داخلی:در طول عملیات، نمونه و استاندارد داخلی با هم مخلوط شده و به ستون کروماتوگرافی تزریق می شود، بنابراین تا زمانی که نسبت مقدار جزء اندازه گیری شده به استاندارد داخلی در محلول مخلوط ثابت باشد، حجم نمونه تغییر می کند. بر نتایج کمی تأثیر نخواهد گذاشت..روش استاندارد داخلی تأثیر حجم نمونه و حتی فاز متحرک و آشکارساز را جبران می کند، بنابراین از روش استاندارد خارجی دقیق تر است.

بخش
08 عوامل مؤثر بر نتایج تحلیل کمی

دقت ضعیف می تواند ناشی از موارد زیر باشد:

ادغام نادرست ناحیه پیک، تجزیه نمونه یا ناخالصی های وارد شده در حین آماده سازی نمونه، بسته نشدن ویال نمونه، تبخیر شدن نمونه یا حلال، آماده سازی نمونه نادرست، مشکلات تزریق نمونه، آماده سازی استاندارد داخلی نادرست

دلایل احتمالی دقت ضعیف:

ادغام نادرست پیک، مشکلات تزریق یا انژکتور، تجزیه نمونه یا ناخالصی های وارد شده در طول آماده سازی نمونه، مشکلات کروماتوگرافی، پاسخ آشکارساز تخریب شده